Selama beberapa dekade terakhir, metode
dengan berbagai pendekatan untuk transfer gen kedalam sel tanaman telah
dieksplorasi. Misalnya microlaser, microinjection, dan pengaplikasian
DNA langsung dalam berbagai variasi dan keberhasilan yang terbatas.
Transformasi pada tanaman padi dengan meletakkan DNA secara langsung
pada stigma segera setelah fertilisasi (saat terbentuk tabung polen)
banyak dikritik karena sulit dibuktikan. Tapi akhir-akhir ini Ziberstein
et al. (1994) mengklaim bahwa beliau berhasil melakukan teknik
semacam ini pada tanaman gandum dan menunjukkan adanya warisan sifat
dari gen asing pada generasi tanaman gandum tersebut secara
berturut-turut. Apabila hal ini benar, maka metode ini bisa menjadi
cara yang paling mudah dan murah untuk rekayasa genetika (genetic engineering).
Transfer gen termediasi Agrobacterium,
berbasis protoplas dan DNA transfer dengan biolistik adalah teknik
utama yang digunakan untuk menghasilkan tanaman transgenik. Transformasi
dengan elektroporasi jaringan termediasi serat silikon carbida (tissue electroporation silicon carbide-fiber mediated transformation) dan microinjection
adalah teknik lebih lanjut yang telah menghasilkan tanaman transgenik
namun belum digunakan secara luas hingga saat ini. Protokol yang elegan
telah berhasil dalam menentukan penggunaan vektor biologis A. tumefaciens sebagaimana transfer gen langsung (direct gene transfer) dalam dasar-dasar sains dan sains terapan.
Permasalahan muncul dari metode serta masalah biologi (genetika) dan introduksi DNA. Namun, masalah biologi lebih banyak daripada masalah cara introduksi DNA. Metode yang berbeda bisa saja memindahkan DNA kedalam sel tanaman, namun saat didalam sel dan organel sel serta nukleus, DNA tersebut tidak dikontrol sehingga DNA asing terintegrasi secara random. Transformasi yang ditargetkan masih dalam keadaan labil. Gene silencing dan interaksi antartransgen menghasilkan ekspresi tak terduga. Beberapa transforman independen dengan konstruksi gen tertentu masih diperlukan untuk menemukan tanaman transgenik dengan bentuk ekspresi yang diinginkan. Mungkin efek posisi gen adalah salah satu penyebabnya, namun bukan juga menjadi satu-satunya penyebab untuk masalah ini.
Penekanan transgen dengan konstruksi antisense bisa saja dicapai, tetapi mekanismenya masih belum jelas. Sampai saat ini fokus utama bioteknologi tanaman adalah strategi penyisipan gen tunggal, dan masih belum praktis untuk mengubah sifat fisiologis yang ditentukan oleh multiple genes (banyak gen) atau sifat yang diwariskan secara kuantitatif. Apabila gen yang menentukan sifat tersebut dipotong, akan memungkinkan untuk menangani sifat poligenik, misal: toleransi terhadap kekeringan (jadi, sifat ketahanan terhadap kekeringan dikendalikan oleh beberapa gen/ banyak gen sehingga namanya poligenik). Pada dasarnya, masalah ini bisa diatasi dengan merekayasa beberapa gen dalam suatu cara atau “pyramiding” dengan menyilangkan individu sebelumnya supaya mengandung single gene tersebut. Pendekatan manapun yang digunakan, transfer terkordinasi pada transgen benar-benar menjadi hal yang sangat penting meskipun upaya menonaktifkan transgen bisa saja mengakibatkan massalah.
Bagaimanapun juga, review singkat ini tidak membahas permasalahan ini, namun lebih utama mengarah pada the state of art pada well established method (metode yang baik untuk digunakan) untuk memindahkan DNA kedalam sel tanaman dan regenerasi tanaman transgenik tersebut. Metode berikut ini akan ditaksir dalam prospek dan perspektifnya: 1) transformasi protoplasma (protoplast transformation); 2) transfer gen secara langsung (direct gene transfer); 3) transfer gen dengan cara biolistik (biolistic gene transfer); 4) transfer gen termediasi Agrobacterioum; 5) transformasi in-planta dan 6) transformasi menggunakan virus. Berikut ulasannya.
1. Direct Gene Transfer
Pendekatan pertama yang digunakan dalam
memindahkan DNA asing kedalam sel tanaman ialah transfer gen secara
langsung ke dalam protoplas. Metode transformasi kimia misalnya PEG atau liposom dan metode transformasi secara fisik (physical method) seperti electroporation
dikembangkan untuk mentransformasi DNA kedalam protoplas. Protoplas
merupakan target ideal (target yang sesuai) untuk transformasi. Tidak
ada barrier/pembatas untuk transfer gen dengan menggunakan
protoplas. Semua protoplas bisa ditransformasikan. Pemindahan DNA
kedalam protoplas relatif mudah, tidak ada kendala berarti. Namun, untuk
meregenerasikan protoplas pascatransformasi masih memiliki
permasalahan yang cukup sulit untuk diatasi. Tantangan utama dalam
metode ini adalah kebutuhan terhadap protokol regenerasi untuk spesies
tertentu bahkan dalam varietas pada satu spesies tertentu. Kekurangan
kedua dari metode ini adalah probabilitas untuk mentransfer lebih dari
satu copy gen. Oleh karena itu, metode ini bisa ditinggalkan saat pendekatan lain lebih memungkinkan untuk digunakan.
[Electroporation = Elektroporasi = Penggunaan tegangan listrik untuk membuka pori-pori membran sel. Dengan terbukanya membran sel, DNA bisa disisipkan atau asimilasi sel pada fusi protoplas bisa dilakukan]
[Protokol = langkah khusus yang dipakai oleh peneliti/ acuan dalam suatu penelitian, bisa dikatakan sebagai SOP]
Di masa depan, protoplas dan direct gene transfer lebih relevan untuk digunakan dalam studi ekspresi sementara (transient expression studies) dan percobaan pada hibridisasi somatis. Hibridisasi simetris ataupun hibridisasi asimetris masih menjadi tool yang bisa dipercaya untuk transfer atau donor kromosom dari spesies yang berkerabat jauh dengan tanaman utama dalam rangka menggabungkan inti atau sitoplasma sel. Teknik ini bahkan bisa dipakai untuk fusi sel tanaman dengan jamur (yeast) yang mungkin penting untuk karakterisasi kromosom jamur buatan. Kelemahan untuk transformasi tunggal adalah prasyarat pada studi tersebut. Protoplas memungkinkan transfer DNA dalam jumlah besar dan organel lain kedalam sel tunggal.
[Hibridisasi protoplas asimetris/simetris = Saat fusi protoplas, ada 2 pendekatan: 1) menghasilkan fusi hibrida sitoplasma (cytoplasmic hybrid, cybrid), di mana sel diharapkan sitoplasmanya bergabung, menyatukan sifat-sifat pewarisan sitoplasmatis, dan 2) pembentukan hibrida dengan yang diharapkan adalah penggabungan inti sel. Untuk itu, protokol ada 2 = simetris: dua sel sama jenis tidak ada yang intinya dibuang terus digabung, asimetris = salah satu sel ada yang intinya dibuang = pewarisan sitoplasmatis].
2. Direct gene transfer across the cell wall without carrier-particles
Dinding sel dianggap sebagai barrier untuk molekul DNA yang berukuran besar, yang mungkin hanya bisa diatasi dengan metode yang forceful (cara tertentu yang kuat, agak memaksa) misalnya mikroinjeksi atau particle gun.
Microinjection adalah metode fisik secara langsung untuk mengintroduksi suatu molekul kedalam sel tunggal tanaman dibawah kendali optik (bisa dilihat dengan mikroskop). Walaupun microinjection adalah satu diantara cara yang sulit dan paling butuh banyak tenaga, cara ini menawarkan keuntungan yang jelas. Jumlah molekul yang ditransfer bisa dikontrol, bisa ditentukan: cotransfer DNA, RNA, protein atau bahkan mitokondria. Transfer molekul bisa dilakukan kedalam sel tunggal bahkan kedalam tanaman secara utuh. Sel individu spesifik bahkan bisa dimonitor sebelumnya, selama proses transfer gen atau setelah transfer gen. Dari beberapa keuntungan ini, microinjection hanya akan digunakan dalam situasi yang sangat khusus. Microinjection akan dikembangkan dengan baik untuk analisis molekul fungsional pada tingkat sel tunggal. Bagaimanapun, dari perspektif rekayasa genetika cara ini bisa sangat signifikan sehingga tanaman yang fertil bisa ditumbuhkan, diregenerasi setelah electrofusion pada gamet yang diisolasi (misal: pada tanaman jagung). Mikrospora pada B. napus (tanaman ini golongan sawi) juga bisa ditargetkan dengan mikroinjeksi.
Akhir-akhir ini, dua atau lebih
metode sederhana dikembangkan untuk transformasi sel utuh utuk eksplan
dan embrio, namanya elektroporasi dan transformasi silikon karbida.
Silikon karbida,
whisker (duri halus silikon karbida). Caranya, sampel dicelup ke larutan
ber-DNA yang akan ditransfer, tambahkan beberapa mikroliter whisker,
lalu divortex. Pemindahan plasmid DNA secara langsung dengan menggunakan
silikon karbida (whiskers) menawarkan opsi yang benar-benar mudah dan
murah untuk menghasilkan tanaman transgenik yang fertil. Suspensi
budidaya sel embriogenik dicampurkan dengan plasmid DNA dan whiskers: menghasilkan tabrakan antara sekelompok sel dengan whiskers
yang menyerupai jarum menghasilkan penetrasi sel dan DNA pun bisa
berpindah. Sampai saat ini, metode ini diaplikasikan pada tanaman jagung
tapi tetapi ada juga yang menggunakan metode serupa untuk transformasi
pada tanaman bunga matahari (sunflower).
Pada electroporation, eksplan yang dalam keadaan multiselular pada tanaman jagung ditransformasi dengan electroporation dikombinasikan dengan pelumatan parsial enzimatis atau tanpa maceration. Xu dan Laursen melaporkan bahwa tanaman padi indica transgenik bisa hidup (fertile) dengan menggunakan elektroporasi untuk mentransfer DNA kedalam sel pada fase embrio. Sesudah itu, kalus embrionik dipilih dan tanaman transgenik yang fertil diregenerasikan selama 3 bulan. Tanaman tebu dan ubi kayu juga berhasil ditransformasikan dengan cara electroporation. Elektroporasi juga berhasil dilakukan pada B. napus tetapi belum menghasilkan tanaman transgenik. Elektroporasi juga berhasil digunakan untuk mentransformasi polen. Beberapa waktu belakangan pencapaian dengan cara elektroporasi dikombinasikan dengan transformasi lipofektin pada bagian ujung meristem pada tanaman kacang polong, buncis, kacang-kacangan, dan kacang tunggak.
3. Direct gene transfer- biolistic approach
Metode biolistik sedikit bergantung pada prosedur modern kultur jaringan dan kemampuan untuk melakukan kultur jaringan. Tidak lama setelah introduksi ini oleh Klein et al. 1987, tanaman buncis transgenik, padi, gandum, dan jagung dihasilkan melalui particle bombardment.
Particle gun menjadi metode transformasi yang digunakan secara luas untuk mengatasi transformasi menggunakan Agrobacterium
dan masalah lain yang diakibatkan oleh sulitnya regenerasi pada teknik
transformasi protoplas. Transformasi pada beberapa spesies rekalsitran
sekarang mungkin dilakukan dengan adanya extended range pada budidaya jaringan dan eksplan yang bisa ditargetkan dengan microprojectiles (partikel yang digunakan untuk transformasi, ex: wolfram, gold). Tanaman gandum transgenik telah dirilis dengan cara somatic embryogenesis dari embrio zigotik yang di-bombarded, sementara itu tanaman buncis transgenik telah berhasil ditumbuhkan dari hasil bombardment
meristem, walaupun frekuensi berpindahnya gen masih rendah karena
masalah dalam hal benih sedikit menghambat pencapaian ini untuk
diaplikasikan secara luas.
Beberapa ulasan menggambarkan evolusi microprojectile bombardment, dari permulaannya sampai pada pengembangannya sebagai metode untuk mentransformasikan bahan genetik (dalam konteks ini adalah dalam hal range spesies yang relatif luas dan kontribusi teknologi ini melampaui batas kingdom tanaman). Murikawa (1994) menekankan pada transformasi polen dan organelnya serta pada mekanisme integrasinya. Stanford et al. (1993) mengulas faktor yang mempengaruhi transfer gen dengan menggunakan particle bombardment. Faktor fisik yang penting adalah percepatan sistem (misalnya gun powder, pemberian arus listrik, serta perbedaan gas yang digunakan), ukuran partikel dan momentum partikel (kalau di pelajaran fisika SMP, momentum suatu partikel atau p= m.và hubungannya dengan massa partikel dan kecepatan gerak partikel. Semakin besar massa dan kecepatan gerak partikel, makin besar momentumnya). Praperlakuan budidaya jaringan (misal: kemampuan osmosis media) yang mempengaruhi faktor biologi jaringan target juga menjadi faktor kritis. Efek destruktif metode ini dikurangi dengan beberapa improvement, tapi bagaimanapun juga semua metode yang bisa digunakan sampai saat ini pasti memiliki kelemahan (limitation(s)). Walaupun gene transfer bisa diketahui pada banyak tempat, akibat dari distribusi partikel umumnya tidak seragam, mengakibatkan kematian pada sel atau gen tersebut tidak ada pada sel di beberapa lokasi. Sebagian besar partikel kelihatannya tertinggal pada beberapa lapisan sel teratas.
Meskipun aplikasi ini memiliki potensi luas, transfer gen secara langsung pada jaringan meristem bunga belum bisa dicapai karena belum adanya teknologi yang sesuai. Suatu sistem transfer gen untuk sel meristem akhir-akhir ini dikembangkan pada pendekatan dasar balistik. Bahkan pada macroprojectile , digunakan azas Bernoulli untuk percepatan penembakan partikel gold berukuran seragam supaya bisa masuk kedalam jaringan tanaman serta mengontrol penetrasi microprojectile tersebut. Sistem ini kemudian bisa memindahkan 80% partikel ke suatu area dengan ukuran diameter sekecil 150 µm yang nantinya berkorespondensi dengan ukuran meristem. Sistem ini memperbaiki pendekatan biolistik yang sebelumnya digunakan pada perkembangan transformasi tangkai bunga dan meristem bunga yang belum masak.
Particle bombardment juga digunakan untuk transformasi organel pada Chlamydomonas dan tembakau. Genom plastida tanaman tingkat tinggi adalah target menarik untuk rekayasa tanaman untuk mengekspresikan transgen pada level yang lebih tinggi. Penargetan gen asing yang lebih efisien kedalam genom plastida tembakau mungkin untuk dilakukan (bahasa gampangnya, plastida ada dalam sel, memberi warna hijau, bersifat hidup, tempat fotosintesis). Pengurungan/ penahanan transgen pada plastida bisa menjadi keuntungan tambahan pada tanaman yang transplastom-nya tidak berhasil ditransmisikan oleh polen (transplastoms, transplastomic = introduksi gen asing bukan pada DNA nukleus, tapi pada DNA organ lain, yaitu kloroplas/plastida).
Pada dasarnya, semua jaringan tanaman bisa dijadikan sebagai target dalam metode biolistik. Material yang dipindahkan bisa saja bervariasi. Disamping plasmid, RNA, bahkan sel E. coli dan Agrobacterium telah berhasil digunakan untuk transformasi. Singkatnya, metode biolistik kelihatannya adalah metode yang paling menjanjikan untuk transformasi pada tanaman dan menanggulangi masalah regenerasi sel tanaman.
4. Agrobacterium-mediated gene transfer
Butuh waktu 2000 tahun setelah adanya deskripsi crown-gall (pada HPT crown-gall disebut kanker, bentuknya tidak beraturan, ditemukan pada tanaman dikotil) oleh Aristoteles dan Theophrastus untuk mendeteksi penyebabnya. Tetapi terjadi perkembangan yang sangat cepat dalam hal sistem transformasi setelah diketahui deskripsi tentang Ti-plasmid (Ti = tumor inducing).
Agrobacterium-mediated gene transfer menjadi cara pilihan yang tepat dan probabilitas tinggi untuk mengintegrasikan single copy. Sistem ini simpel, murah, dan efisien dalam banyak kasus. Ratusan spesies tanaman telah ditransformasikan dengan cara ini. Agrobacterium co-cultivation (kultivasi secara bersamaan) sukses digunakan untuk mentransformasi daun, akar, hipokotil, petiola (tangkai), kotiledon, embrio yang berasal dari serbuk sari, biji (seed), dan bahkan tanaman.
Sebagian besar transfer DNA secara langsung dilakukan menggunakan plasmid DNA yang mengandung gene of interest (goi= gen yang diinginkan untuk tersisip). Plasmid ini terdapat dalam sel yang ditransformasi, terdapat penambahan gene of interest, kopian terfragmentasi, atau atau vektor pada lokasi yang berbeda dalam genom. Dalam perbandingannya, Agrobacterium-mediated insertion biasanya lebih tepat (presisi), DNA diantara dua border tertentu ditransfer secara lengkap. Perbedaan lainnya, Agrobacterium-mediated transformation sering kali hanya menghasilkan satu kopian (jumlahnya terbatas). Kenapa? Karena ukuran plasmid terbatas.
Bagaimanapun juga, transformasi menggunakan Agrobacterium dibatasi oleh ukuran DNA yang ditransferkan dan range host (rentang host/ inang dari bakteri) dari Agrobacterium. Tanaman monokotil yang termasuk tanaman paling penting bukanlah inang dari Agrobacterium sehingga tidak bisa diinfeksi oleh Agrobacterium.
Agrobacterium bisa mengintroduksi T-DNA kedalam berbagai spesies tanaman yang berbeda, bahkan beberapa spesies yang tidak merespon pembentukan tumor. Pertama kalinya Grimslet et al. (1987) berhasil mentransformasikan sel tanaman jagung menggunakan Agrobacterium. Bahkan setelah itu ditunjukkan bahwa efisiensi transfer T-DNA semacam itu berhubungan dengan spesies dikotil dan arti penting dari gen virA untuk berinteraksi dengan bakteri dan tanaman monokotil. Akhirnya, tanaman padi transgenik dan jagung transgenik diperoleh dengan Agrobacterium-mediated gene transfer.
5. In planta transformation- Unusual methode for a tiny plant
Transformasi benih (seed), transformasi dengan a. infiltrasi vakum dan b. in planta inoculation pada tanaman Arabidopsis thaliana adalah Agrobacterium-mediated gene transfer. Pembagian topik ini dilakukan untuk melompati sebuah step dalam budidaya jaringan.
Untuk transformasi seed pada tanaman A. thaliana dalam jumlah banyak, maka benihnya diimbibisi (imbibisi dilakukan untuk merangsang pertumbuhan awal/ kecambah) dengan cepat dan setelah itu dilalukan co-cultivated dengan A. tumefaciens selama satu hari. Tanaman tumbuh, dan anakan ini di-screening dengan insersi T-DNA. Dengan cara ini, suatu populasi tanaman transgenik dalam jumlah relatif besar ditumbuhkan dengan menggunakan “gene tagging” oleh T-DNA. Tetapi, seed transformation ini agak sulit untuk bereproduksi dan transformasinya pun bergantung kepada beberapa faktor yang bervariasi.
Pendekatan kedua yaitu berdasarkan infiltrasi vakum dari suspensi sel Agrobacterium yang mengandung vektor T-DNA biner (binary T-DNA vector) kedalam tanaman A. thaliana yang sedang berbunga. Sekedar info saja, Vektor biner = Vektor ganda. Dalam transformasi Agrotumefaciens, ada penggunaan vektor plasmid tunggal dan ganda. Ganda biasanya dipakai kalau material DNA-nya ingin disimpan (biasanya di E. coli) sebelum ditransformasi ke Agrobacterium dan baru ke tanaman, atau kalau DNA-nya berukuran terlalu besar.
Pada saat karakterisasi, tanaman diidentifikasi antara tanaman yang membawa gen asing dengan tanaman yang tidak membawa gen asing dengan melihat bagian vegetatifnya. Sampai 5 transforman per kelompok inokulasi bisa dipulihkan dari tanaman yang diinokulasi. Analisis genetik dan molekuler menunjukkan bahwa transformasi terjadi secara lambat selama perkembangan bunga karena semua transforman bersifat homozigot. Dan mengandung T-DNA yang berbeda. Prosedur transformasi melibatkan tunas apikal yang terpotong pada bagian dasarnya, inokulasi dengan Agrobacterium pada bagian yang terluka, dan kemudian generasi dari tunas yang berasal dari bagian yang terpotong. Rata-rata 5,5 % bentukan baru menghasilkan progeni yang tertransformasi.
Keuntungan utama dari metode ini adalah tekniknya sederhana, semua tahap bisa digunakan pada semua tanaman hortikultura dan pada kondisi tidak steril. Disamping itu, juga tidak dibutuhkan teknik budidaya jaringan secara in vitro. Jadi, tidak perlu kondisi steril.
Metode ini telah dikembangkan dan diperbaiki untuk tanaman berukuran kecil, A. thaliana. Scale up (perbanyakan) untuk B. napus dan Beta vulgaris belum ada yang berhasil. Pada dasarnya, seharusnya juga memungkinkan untuk menyesuaikan metode transformasi pada spesies rekalsitran untuk diperbanyak dengan budidaya jaringan atau regenerasinya, tetapi sampai sekarang metode transfer untuk spesies lain yang lebih relevan belum diketahui.
6. Viral transformation vectors
Vektor virus belum digunakan secara luas pada tanaman sebagaimana pada bakteri dan mamalia. Mungkin ini karena metode lain lebih efisien dilakukan untuk tanaman. Vektor virus belum bisa membuat transforman yang stabil melalui integrasi atau transmisi melampaui “germline” nya. Virus sebagai vektor pembawa untuk mentransformasi tanaman masih diselidiki untuk menjawab pertanyaan dasar pada penetapan sistem transformasi yang baru.
Singkatnya, virus memungkinkan ekspresi gen dipelajari tanpa adanya variasi yang dihasilkan dari lokasi kromosom. Sektor virus juga memungkinkan karakterisasi gen dalam diferensiasi jaringan tanpa membutuhkan budidaya jaringan. Selanjutnya, kemampuan virus untuk menyebar secara sistemik melalui tanaman dapat menghasilkan ekspresi yang sangat tepat pada gen target. Pendekatan ini lebih lanjut digunakan untuk mengembangkan replikasi RNA virus secara otonom untuk memproduksi protein heterozigot pada tanaman. Vektornya diperoleh dari modified tobacco mosaic virus, potato virus X, atau virus kerdil tanaman kentang yang tidak menimbulkan gejala penyakit namun tersebar secara sistemik dan mengandung gen asing.
artikel ini disalin lengkap dari: http://eka-putri-a.blog.ugm.ac.id/index.php/2014/06/13/metode-transformasi-dna-pada-tanaman/
halaman utama website: http://eka-putri-a.blog.ugm.ac.id/
Jika ada waktu, Dimohon untuk Membuka Halaman Utama website yang telah saya salin artikelnya ya!
Permasalahan muncul dari metode serta masalah biologi (genetika) dan introduksi DNA. Namun, masalah biologi lebih banyak daripada masalah cara introduksi DNA. Metode yang berbeda bisa saja memindahkan DNA kedalam sel tanaman, namun saat didalam sel dan organel sel serta nukleus, DNA tersebut tidak dikontrol sehingga DNA asing terintegrasi secara random. Transformasi yang ditargetkan masih dalam keadaan labil. Gene silencing dan interaksi antartransgen menghasilkan ekspresi tak terduga. Beberapa transforman independen dengan konstruksi gen tertentu masih diperlukan untuk menemukan tanaman transgenik dengan bentuk ekspresi yang diinginkan. Mungkin efek posisi gen adalah salah satu penyebabnya, namun bukan juga menjadi satu-satunya penyebab untuk masalah ini.
Penekanan transgen dengan konstruksi antisense bisa saja dicapai, tetapi mekanismenya masih belum jelas. Sampai saat ini fokus utama bioteknologi tanaman adalah strategi penyisipan gen tunggal, dan masih belum praktis untuk mengubah sifat fisiologis yang ditentukan oleh multiple genes (banyak gen) atau sifat yang diwariskan secara kuantitatif. Apabila gen yang menentukan sifat tersebut dipotong, akan memungkinkan untuk menangani sifat poligenik, misal: toleransi terhadap kekeringan (jadi, sifat ketahanan terhadap kekeringan dikendalikan oleh beberapa gen/ banyak gen sehingga namanya poligenik). Pada dasarnya, masalah ini bisa diatasi dengan merekayasa beberapa gen dalam suatu cara atau “pyramiding” dengan menyilangkan individu sebelumnya supaya mengandung single gene tersebut. Pendekatan manapun yang digunakan, transfer terkordinasi pada transgen benar-benar menjadi hal yang sangat penting meskipun upaya menonaktifkan transgen bisa saja mengakibatkan massalah.
Bagaimanapun juga, review singkat ini tidak membahas permasalahan ini, namun lebih utama mengarah pada the state of art pada well established method (metode yang baik untuk digunakan) untuk memindahkan DNA kedalam sel tanaman dan regenerasi tanaman transgenik tersebut. Metode berikut ini akan ditaksir dalam prospek dan perspektifnya: 1) transformasi protoplasma (protoplast transformation); 2) transfer gen secara langsung (direct gene transfer); 3) transfer gen dengan cara biolistik (biolistic gene transfer); 4) transfer gen termediasi Agrobacterioum; 5) transformasi in-planta dan 6) transformasi menggunakan virus. Berikut ulasannya.
1. Direct Gene Transfer
Alur Elektroporasi. Sumber: http://www.whatisthebiotechnology.com/blog/wp-content/uploads/2013/10/A.png
[Electroporation = Elektroporasi = Penggunaan tegangan listrik untuk membuka pori-pori membran sel. Dengan terbukanya membran sel, DNA bisa disisipkan atau asimilasi sel pada fusi protoplas bisa dilakukan]
[Protokol = langkah khusus yang dipakai oleh peneliti/ acuan dalam suatu penelitian, bisa dikatakan sebagai SOP]
Di masa depan, protoplas dan direct gene transfer lebih relevan untuk digunakan dalam studi ekspresi sementara (transient expression studies) dan percobaan pada hibridisasi somatis. Hibridisasi simetris ataupun hibridisasi asimetris masih menjadi tool yang bisa dipercaya untuk transfer atau donor kromosom dari spesies yang berkerabat jauh dengan tanaman utama dalam rangka menggabungkan inti atau sitoplasma sel. Teknik ini bahkan bisa dipakai untuk fusi sel tanaman dengan jamur (yeast) yang mungkin penting untuk karakterisasi kromosom jamur buatan. Kelemahan untuk transformasi tunggal adalah prasyarat pada studi tersebut. Protoplas memungkinkan transfer DNA dalam jumlah besar dan organel lain kedalam sel tunggal.
[Hibridisasi protoplas asimetris/simetris = Saat fusi protoplas, ada 2 pendekatan: 1) menghasilkan fusi hibrida sitoplasma (cytoplasmic hybrid, cybrid), di mana sel diharapkan sitoplasmanya bergabung, menyatukan sifat-sifat pewarisan sitoplasmatis, dan 2) pembentukan hibrida dengan yang diharapkan adalah penggabungan inti sel. Untuk itu, protokol ada 2 = simetris: dua sel sama jenis tidak ada yang intinya dibuang terus digabung, asimetris = salah satu sel ada yang intinya dibuang = pewarisan sitoplasmatis].
2. Direct gene transfer across the cell wall without carrier-particles
Dinding sel dianggap sebagai barrier untuk molekul DNA yang berukuran besar, yang mungkin hanya bisa diatasi dengan metode yang forceful (cara tertentu yang kuat, agak memaksa) misalnya mikroinjeksi atau particle gun.
Microinjection adalah metode fisik secara langsung untuk mengintroduksi suatu molekul kedalam sel tunggal tanaman dibawah kendali optik (bisa dilihat dengan mikroskop). Walaupun microinjection adalah satu diantara cara yang sulit dan paling butuh banyak tenaga, cara ini menawarkan keuntungan yang jelas. Jumlah molekul yang ditransfer bisa dikontrol, bisa ditentukan: cotransfer DNA, RNA, protein atau bahkan mitokondria. Transfer molekul bisa dilakukan kedalam sel tunggal bahkan kedalam tanaman secara utuh. Sel individu spesifik bahkan bisa dimonitor sebelumnya, selama proses transfer gen atau setelah transfer gen. Dari beberapa keuntungan ini, microinjection hanya akan digunakan dalam situasi yang sangat khusus. Microinjection akan dikembangkan dengan baik untuk analisis molekul fungsional pada tingkat sel tunggal. Bagaimanapun, dari perspektif rekayasa genetika cara ini bisa sangat signifikan sehingga tanaman yang fertil bisa ditumbuhkan, diregenerasi setelah electrofusion pada gamet yang diisolasi (misal: pada tanaman jagung). Mikrospora pada B. napus (tanaman ini golongan sawi) juga bisa ditargetkan dengan mikroinjeksi.
Mikroinjeksi DNA Asing Langsung kedalam Inti Protoplas. Sumber: http://www.cdb.riken.jp/fsc2009/image/Microinjection(LARGE).jpg
Silikon Karbida. Sumber: https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiMMND3rRsuPjbaIM9vb5JmP3AJ7iXSXAGcmj0k6Dono69JZ5o6U4q8qOZvXJptQHwY0FGE_BJdqrmCx61sYIOdfOmtf7kuvcKVBvyGv38t4L6TyswbSBfoMwj7V8VvprHoypwa_BKonWan/s1600/whiskers+1.jpg
Pada electroporation, eksplan yang dalam keadaan multiselular pada tanaman jagung ditransformasi dengan electroporation dikombinasikan dengan pelumatan parsial enzimatis atau tanpa maceration. Xu dan Laursen melaporkan bahwa tanaman padi indica transgenik bisa hidup (fertile) dengan menggunakan elektroporasi untuk mentransfer DNA kedalam sel pada fase embrio. Sesudah itu, kalus embrionik dipilih dan tanaman transgenik yang fertil diregenerasikan selama 3 bulan. Tanaman tebu dan ubi kayu juga berhasil ditransformasikan dengan cara electroporation. Elektroporasi juga berhasil dilakukan pada B. napus tetapi belum menghasilkan tanaman transgenik. Elektroporasi juga berhasil digunakan untuk mentransformasi polen. Beberapa waktu belakangan pencapaian dengan cara elektroporasi dikombinasikan dengan transformasi lipofektin pada bagian ujung meristem pada tanaman kacang polong, buncis, kacang-kacangan, dan kacang tunggak.
3. Direct gene transfer- biolistic approach
Metode biolistik sedikit bergantung pada prosedur modern kultur jaringan dan kemampuan untuk melakukan kultur jaringan. Tidak lama setelah introduksi ini oleh Klein et al. 1987, tanaman buncis transgenik, padi, gandum, dan jagung dihasilkan melalui particle bombardment.
Particle Bombardment. Sumber: http://www.nepadbiosafety.net/abne/wp-content/uploads/2010/10/diagrammatic.png
Beberapa ulasan menggambarkan evolusi microprojectile bombardment, dari permulaannya sampai pada pengembangannya sebagai metode untuk mentransformasikan bahan genetik (dalam konteks ini adalah dalam hal range spesies yang relatif luas dan kontribusi teknologi ini melampaui batas kingdom tanaman). Murikawa (1994) menekankan pada transformasi polen dan organelnya serta pada mekanisme integrasinya. Stanford et al. (1993) mengulas faktor yang mempengaruhi transfer gen dengan menggunakan particle bombardment. Faktor fisik yang penting adalah percepatan sistem (misalnya gun powder, pemberian arus listrik, serta perbedaan gas yang digunakan), ukuran partikel dan momentum partikel (kalau di pelajaran fisika SMP, momentum suatu partikel atau p= m.và hubungannya dengan massa partikel dan kecepatan gerak partikel. Semakin besar massa dan kecepatan gerak partikel, makin besar momentumnya). Praperlakuan budidaya jaringan (misal: kemampuan osmosis media) yang mempengaruhi faktor biologi jaringan target juga menjadi faktor kritis. Efek destruktif metode ini dikurangi dengan beberapa improvement, tapi bagaimanapun juga semua metode yang bisa digunakan sampai saat ini pasti memiliki kelemahan (limitation(s)). Walaupun gene transfer bisa diketahui pada banyak tempat, akibat dari distribusi partikel umumnya tidak seragam, mengakibatkan kematian pada sel atau gen tersebut tidak ada pada sel di beberapa lokasi. Sebagian besar partikel kelihatannya tertinggal pada beberapa lapisan sel teratas.
Meskipun aplikasi ini memiliki potensi luas, transfer gen secara langsung pada jaringan meristem bunga belum bisa dicapai karena belum adanya teknologi yang sesuai. Suatu sistem transfer gen untuk sel meristem akhir-akhir ini dikembangkan pada pendekatan dasar balistik. Bahkan pada macroprojectile , digunakan azas Bernoulli untuk percepatan penembakan partikel gold berukuran seragam supaya bisa masuk kedalam jaringan tanaman serta mengontrol penetrasi microprojectile tersebut. Sistem ini kemudian bisa memindahkan 80% partikel ke suatu area dengan ukuran diameter sekecil 150 µm yang nantinya berkorespondensi dengan ukuran meristem. Sistem ini memperbaiki pendekatan biolistik yang sebelumnya digunakan pada perkembangan transformasi tangkai bunga dan meristem bunga yang belum masak.
Particle bombardment juga digunakan untuk transformasi organel pada Chlamydomonas dan tembakau. Genom plastida tanaman tingkat tinggi adalah target menarik untuk rekayasa tanaman untuk mengekspresikan transgen pada level yang lebih tinggi. Penargetan gen asing yang lebih efisien kedalam genom plastida tembakau mungkin untuk dilakukan (bahasa gampangnya, plastida ada dalam sel, memberi warna hijau, bersifat hidup, tempat fotosintesis). Pengurungan/ penahanan transgen pada plastida bisa menjadi keuntungan tambahan pada tanaman yang transplastom-nya tidak berhasil ditransmisikan oleh polen (transplastoms, transplastomic = introduksi gen asing bukan pada DNA nukleus, tapi pada DNA organ lain, yaitu kloroplas/plastida).
Pada dasarnya, semua jaringan tanaman bisa dijadikan sebagai target dalam metode biolistik. Material yang dipindahkan bisa saja bervariasi. Disamping plasmid, RNA, bahkan sel E. coli dan Agrobacterium telah berhasil digunakan untuk transformasi. Singkatnya, metode biolistik kelihatannya adalah metode yang paling menjanjikan untuk transformasi pada tanaman dan menanggulangi masalah regenerasi sel tanaman.
4. Agrobacterium-mediated gene transfer
Butuh waktu 2000 tahun setelah adanya deskripsi crown-gall (pada HPT crown-gall disebut kanker, bentuknya tidak beraturan, ditemukan pada tanaman dikotil) oleh Aristoteles dan Theophrastus untuk mendeteksi penyebabnya. Tetapi terjadi perkembangan yang sangat cepat dalam hal sistem transformasi setelah diketahui deskripsi tentang Ti-plasmid (Ti = tumor inducing).
Agrobacterium-mediated gene transfer menjadi cara pilihan yang tepat dan probabilitas tinggi untuk mengintegrasikan single copy. Sistem ini simpel, murah, dan efisien dalam banyak kasus. Ratusan spesies tanaman telah ditransformasikan dengan cara ini. Agrobacterium co-cultivation (kultivasi secara bersamaan) sukses digunakan untuk mentransformasi daun, akar, hipokotil, petiola (tangkai), kotiledon, embrio yang berasal dari serbuk sari, biji (seed), dan bahkan tanaman.
Sebagian besar transfer DNA secara langsung dilakukan menggunakan plasmid DNA yang mengandung gene of interest (goi= gen yang diinginkan untuk tersisip). Plasmid ini terdapat dalam sel yang ditransformasi, terdapat penambahan gene of interest, kopian terfragmentasi, atau atau vektor pada lokasi yang berbeda dalam genom. Dalam perbandingannya, Agrobacterium-mediated insertion biasanya lebih tepat (presisi), DNA diantara dua border tertentu ditransfer secara lengkap. Perbedaan lainnya, Agrobacterium-mediated transformation sering kali hanya menghasilkan satu kopian (jumlahnya terbatas). Kenapa? Karena ukuran plasmid terbatas.
Bagaimanapun juga, transformasi menggunakan Agrobacterium dibatasi oleh ukuran DNA yang ditransferkan dan range host (rentang host/ inang dari bakteri) dari Agrobacterium. Tanaman monokotil yang termasuk tanaman paling penting bukanlah inang dari Agrobacterium sehingga tidak bisa diinfeksi oleh Agrobacterium.
Agrobacterium bisa mengintroduksi T-DNA kedalam berbagai spesies tanaman yang berbeda, bahkan beberapa spesies yang tidak merespon pembentukan tumor. Pertama kalinya Grimslet et al. (1987) berhasil mentransformasikan sel tanaman jagung menggunakan Agrobacterium. Bahkan setelah itu ditunjukkan bahwa efisiensi transfer T-DNA semacam itu berhubungan dengan spesies dikotil dan arti penting dari gen virA untuk berinteraksi dengan bakteri dan tanaman monokotil. Akhirnya, tanaman padi transgenik dan jagung transgenik diperoleh dengan Agrobacterium-mediated gene transfer.
5. In planta transformation- Unusual methode for a tiny plant
Transformasi benih (seed), transformasi dengan a. infiltrasi vakum dan b. in planta inoculation pada tanaman Arabidopsis thaliana adalah Agrobacterium-mediated gene transfer. Pembagian topik ini dilakukan untuk melompati sebuah step dalam budidaya jaringan.
Untuk transformasi seed pada tanaman A. thaliana dalam jumlah banyak, maka benihnya diimbibisi (imbibisi dilakukan untuk merangsang pertumbuhan awal/ kecambah) dengan cepat dan setelah itu dilalukan co-cultivated dengan A. tumefaciens selama satu hari. Tanaman tumbuh, dan anakan ini di-screening dengan insersi T-DNA. Dengan cara ini, suatu populasi tanaman transgenik dalam jumlah relatif besar ditumbuhkan dengan menggunakan “gene tagging” oleh T-DNA. Tetapi, seed transformation ini agak sulit untuk bereproduksi dan transformasinya pun bergantung kepada beberapa faktor yang bervariasi.
Pendekatan kedua yaitu berdasarkan infiltrasi vakum dari suspensi sel Agrobacterium yang mengandung vektor T-DNA biner (binary T-DNA vector) kedalam tanaman A. thaliana yang sedang berbunga. Sekedar info saja, Vektor biner = Vektor ganda. Dalam transformasi Agrotumefaciens, ada penggunaan vektor plasmid tunggal dan ganda. Ganda biasanya dipakai kalau material DNA-nya ingin disimpan (biasanya di E. coli) sebelum ditransformasi ke Agrobacterium dan baru ke tanaman, atau kalau DNA-nya berukuran terlalu besar.
Pada saat karakterisasi, tanaman diidentifikasi antara tanaman yang membawa gen asing dengan tanaman yang tidak membawa gen asing dengan melihat bagian vegetatifnya. Sampai 5 transforman per kelompok inokulasi bisa dipulihkan dari tanaman yang diinokulasi. Analisis genetik dan molekuler menunjukkan bahwa transformasi terjadi secara lambat selama perkembangan bunga karena semua transforman bersifat homozigot. Dan mengandung T-DNA yang berbeda. Prosedur transformasi melibatkan tunas apikal yang terpotong pada bagian dasarnya, inokulasi dengan Agrobacterium pada bagian yang terluka, dan kemudian generasi dari tunas yang berasal dari bagian yang terpotong. Rata-rata 5,5 % bentukan baru menghasilkan progeni yang tertransformasi.
Keuntungan utama dari metode ini adalah tekniknya sederhana, semua tahap bisa digunakan pada semua tanaman hortikultura dan pada kondisi tidak steril. Disamping itu, juga tidak dibutuhkan teknik budidaya jaringan secara in vitro. Jadi, tidak perlu kondisi steril.
Metode ini telah dikembangkan dan diperbaiki untuk tanaman berukuran kecil, A. thaliana. Scale up (perbanyakan) untuk B. napus dan Beta vulgaris belum ada yang berhasil. Pada dasarnya, seharusnya juga memungkinkan untuk menyesuaikan metode transformasi pada spesies rekalsitran untuk diperbanyak dengan budidaya jaringan atau regenerasinya, tetapi sampai sekarang metode transfer untuk spesies lain yang lebih relevan belum diketahui.
6. Viral transformation vectors
Vektor virus belum digunakan secara luas pada tanaman sebagaimana pada bakteri dan mamalia. Mungkin ini karena metode lain lebih efisien dilakukan untuk tanaman. Vektor virus belum bisa membuat transforman yang stabil melalui integrasi atau transmisi melampaui “germline” nya. Virus sebagai vektor pembawa untuk mentransformasi tanaman masih diselidiki untuk menjawab pertanyaan dasar pada penetapan sistem transformasi yang baru.
Singkatnya, virus memungkinkan ekspresi gen dipelajari tanpa adanya variasi yang dihasilkan dari lokasi kromosom. Sektor virus juga memungkinkan karakterisasi gen dalam diferensiasi jaringan tanpa membutuhkan budidaya jaringan. Selanjutnya, kemampuan virus untuk menyebar secara sistemik melalui tanaman dapat menghasilkan ekspresi yang sangat tepat pada gen target. Pendekatan ini lebih lanjut digunakan untuk mengembangkan replikasi RNA virus secara otonom untuk memproduksi protein heterozigot pada tanaman. Vektornya diperoleh dari modified tobacco mosaic virus, potato virus X, atau virus kerdil tanaman kentang yang tidak menimbulkan gejala penyakit namun tersebar secara sistemik dan mengandung gen asing.
artikel ini disalin lengkap dari: http://eka-putri-a.blog.ugm.ac.id/index.php/2014/06/13/metode-transformasi-dna-pada-tanaman/
halaman utama website: http://eka-putri-a.blog.ugm.ac.id/
Jika ada waktu, Dimohon untuk Membuka Halaman Utama website yang telah saya salin artikelnya ya!
No comments:
Post a Comment